Применение спектрофотометрии в фармацевтическом анализе

Для подтверждения подлинности лекарственных средств спектрофотометрическим методом используют несколько подходов. Самый распространенный – это сравнение спектров анализируемого образца и стандартного образца этого же вещества.

В этом случае используют стандартные образцы (Reference Materials, Reference Standards, Reference Substances) вещества, достаточно однородные и стабильные в отношении некоторых специфических свойств, которые признаны подходящими к применению при проведении измерений или испытаний указанных свойств.

Для анализа фармакопейных субстанций применяются государственные стандартные образцы (стандартные образцы, параметры качества которых регламентируются фармакопейной статьей, утвержденной в установленном порядке). Раствор стандартного образца должен быть приготовлен в тех же условиях и с применением тех же растворителей, что и раствор испытуемого вещества.

Спектры веществ должны совпадать по положению максимумов, минимумов и плато, а величины светопоглощения в максимумах не должны различаться более чем на 3%. В этом случае результат анализа наиболее достоверен, однако существенно осложняет работу дефицит и высокая стоимость стандартных образцов.

При отсутствии стандартного образца допускается указание в нормативной документации максимумов и минимумов светопоглощения, которые следует сравнивать с данными, полученными при анализе. Так, в фармакопейной статье, регламентирующей качество экстракта солодки, имеется указание «УФ-спектр раствора, приготовленного для количественного определения, в области от 200 до 360 нм должен иметь максимум при длине волны (258 ± 2) нм».

Иногда при испытании на подлинность рассчитывают удельный показатель поглощения в максимуме и сравнивают его со значением, приведенном в нормативной документации. Это позволяет решить вопрос с дефицитом стандартных образцов, но, в то же самое время, такие методики имеют существенный недостаток: на результат анализа влияют характеристики прибора.

Для решения этой проблемы используют довольно удобный прием: для вещества рассчитывают отношение величин абсорбции при двух максимумах. Такой способ рекомендуют, например, при анализе цианокобаламина – «отношение оптических плотностей А361/А550 должно составлять от 3,10 до 3,45; отношение оптических плотностей А361/А278 должно составлять от 1,70 до 1,9».

Иногда при проведении испытания аналитик сталкивается с необходимостью повышения чувствительности и/или специфичности методики определения. В этом случае целесообразно использовать метод дифференциальной спектрофотометрии, когда к анализируемому веществу добавляют специфический реактив. Дифференциальная спектрофотомерия применяется в анализе многих лекарственных веществ.

Похожие приемы используют для анализа аминокислот – так, при спектрофотометрическом определении таурина к раствору добавляют нингидрин, доводят рН и температуру до «точки оптимума», выдерживают раствор в течение некоторого времени и снимают спектр полученного окрашенного комплекса.

Одним из вариантов дифференциальной спектрофотометрии является так называемая ΔЕ – спектрофотометрия, когда фиксируют изменение оптической плотности, произошедшее в результате перехода вещества из одной таутомерной формы в другую. Так, при анализе производных барбитуровой кислоты, используют метод, предложенный В.Г. Беликовым: спектр поглощения раствора снимают при разных значениях рН. При значении рН = 2 барбитурат существует в виде лактамной формы, при изменении рН до 10 – переходит в лактимную, а при дальнейшем увеличении водородного показателя (рН =13) – в дилактимную (рисунок 1).

Рисунок 1. Лактим-лактамная таутомерия барбитуратов

Спектр поглощения при этом также претерпевает изменения, что позволяет не только идентифицировать производные барбитуровой кислоты, но и дифференцировать их по положению заместителей.

Так, 5,5 – замещенные барбитуратов в лактамной (имидной) форме не имеет хромофорной системы (сопряженных простых и двойных связей), абсорбирующей электромагнитное излучение в УФ – области. Молекула в лактимной (имидольной) форме такую систему уже имеет, способна к абсорбции в данной области и имеет максимум светопоглощения при 240 нм.

Дилактимная (диимидольная) форма имеет еще одну двойную связь – хромофорная система удлиняется, и в спектре происходит батохромный сдвиг. Максимум светопоглощения при этом смещается в область 255-260 нм (рисунок 2).

Рисунок 2. Изменение спектра поглощения 5,5-замещенных барбитуратов в зависимости от рН раствора

Барбитураты, имеющие в молекуле три заместителя, способны к существованию только в одной ионизированной таутомерной форме – лактамной и имеют максимум светопоглощения при 245 нм, который не смещается при изменении рН.

Спектр поглощения тиобарбитуратов имеет по два максимума при рН = 2 (239 и 260 нм) и при рН = 10 (255 и 310 нм), в сильнощелочной среде, при рН=13, наблюдается один максимум (310 нм).

Таким образом, применение спектрофотометрии может дать некоторые представления о свойствах исследуемых веществ (наличие и изменение хромофорных и ауксохромных групп). Так, наличие в структуре лекарственного вещества фенольного гидроксила имеются полосы поглощения при 251, 257 и 263 нм, замещенные ароматические радикалы обуславливают максимум светопоглощения при 260 нм, сопряженные двойные связи – при 238 нм.

(Макиева М.С., Морозов Ю.А., Морозова Е.В., Морозов В.А. Оптические методы анализа лекарственных средств, ИПЦ Сев. Осет. гос. ун-т им. К. Л. Хетагурова)